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更有效,更精准,更安全——外显子捕获与CRISPR基因编辑在免疫治疗中的应用

作者:广州天祥生物科技有限公司 浏览: 发表时间:2020-09-11 14:08:30

来PD-1/PD-L1和CAR-T作为肿瘤免疫治疗领域的新星,为人类对抗癌症提供了“新式武器”,为精准治疗注入了新活力。


 更有效的诊断

肿瘤的免疫治疗,一旦发挥作用,有显著持久的疗效。但是临床研究显示,只有部分肿瘤病人会在这种治疗方式中获益。因此研究和挖掘肿瘤生物标志物对筛选患者,制定有效治疗方案和疗效追踪及疗效评估具有重要意义。

更安全的“武器”

简单高效的“基因魔剪” —CRISPR的快速发展,虽然为基因治疗铺平了道路,但是其脱靶效应引起的安全性问题仍富有争议。在基因编辑的同时也要保证安全性,不能产生对基因组的未知编辑,造成“杀敌一千,自损八百”的意外。

肿瘤免疫治疗中的生物标志物 


 我们现在以下面三种生物标志物为例,进行简单介绍.


TMB,全称“肿瘤突变负荷”(Tumor mutational burden),通常用肿瘤细胞基因组编码区的百万碱基突变数来衡量,包含点突变、插入/缺失突变、融合突变、基因组重排、重复突变等多种类型的突变。

2017年,《新英格兰医学杂志》总结了TMB与PD-1抑制剂有效率相关性,涉及27种肿瘤类型/亚型,横坐标为TMB值,纵坐标为PD-1抑制剂的客观缓解率。一般而言,TMB值越高表明突变数量越多,产生新抗原可能性也越高,因而进行ICB免疫治疗的应答率也相应增加。                          


目前,通常使用全外显子靶向测序技术(Whole Exome Sequencing,WES)对基因编码区域的体细胞突变数量进行统计分析与计算TMB。


MSI,即微卫星不稳定(Microsatellite instability,MSI)是指由于基因组无法正确修复,导致微卫星DNA的插入或缺失改变。WES测序数据不仅可以考察错配修复(Mismatch repair,MMR)基因的相关突变,还能够直接用于MSI分析[2]。


近年来研究表明HLA分型也与免疫治疗效果相关。2018年初的《科学》期刊发表的文献表明HLA-I杂合患者使用ICB进行免疫治疗的生存状况更好,而高TMB且HLA-I杂合的患者获益更多[3]。所以,覆盖HLA相关基因的WES Panel的测序数据结合其他可以更好帮助制定免疫治疗方案[4]。


针对肿瘤免疫治疗生物标志物

核心外显子捕获Panel


IDT WES捕获探针,xGen® Exome Research Panel,覆盖全基因组19,396个基因的编码区域,是一款针对于基因编码区域的核心外显子捕获Panel,可实现高达90%的中靶效率。

基于IDT领先的合成技术,每一条探针均独立合成、独立质控,序列清晰,浓度明确。该Panel适用于全面的基因组分析,如SNV,CNV等,还可实现TMB、MSI的检测分析;利用MMR和HLA相关基因可对MSI和HLA进行辅助分析[4,5,6]。


在靶向杂交捕获实验中,xGen®️ Exome Research Panel支持多样本混合(可高至12个样本)后杂交,大大节约了捕获成本。由于在GC-rich等区域具有更好的覆盖,捕获均一性高,还可节约测序成本。

如图3所示,IDT提供WES靶向捕获测序的整体解决方案。除了核心外显子捕获Panel,客户可以定制用于捕获特定肿瘤免疫相关基因/位点的探针补充进入其中形成特色Panel。另外,配套的通用封阻序列和杂交洗脱试剂,帮助得到靶向捕获的最佳表现。另外纳昂达公司针对目前Illumina高通量测序平台x-Ten和NovaSeq等平台存在的样本标签跳跃问题提供双端唯一Index的接头,可以有效剔除各个阶段产生的样本标签错配。


CRISPR与CAR-T细胞免疫治疗

CRISPR-Cas9这种简单高效的基因编辑技术,在治疗由DNA突变引起的各类病症中均有很大潜力。而其在癌症免疫治疗中的应用研究已在全世界范围内开展,并取得了一些突破。

嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(CAR-T,Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy,)是通过逆转录病毒或慢病毒将CAR基因传递到T细胞的基因组内。解放军总医院韩卫东团队,基于CAR-T技术,在B细胞淋巴瘤与白血病患者提取的T细胞表达针对CD19的抗原,UCART019。这使得编辑过的T细胞可高效识别并杀死表达CD19的致癌B细胞[7]。但实验的不同之处在于同时引入了CRISPR系统,可抑制内源TCR和B2M基因,以期提高治疗效果。

传统的逆转录病毒或慢病毒法,会导致CAR基因被随机插入到受体T细胞的基因组中,从而引发潜在的遗传副作用。来自纪念斯隆—凯特琳癌症中心的研究人员利用CRISPR-Cas9技术可定向插入CAR基因,并在小鼠中验证了其肿瘤抑制作用,有助于未来癌症免疫疗法的发展[8]。


高特异性精准编辑

 Alt-R CRISPR基因编辑系统


CRISPR应用于临床治疗中,其脱靶效必须得到控制的。基于大量研究发现的高保真Cas9,可实现极低脱靶率,但是编辑效率则明显低于野生型[9]。

IDT的科学家利用独特的筛选平台,通过对25万多种Cas9突变体评估和优化,推出的Alt-R®️ HiFi Cas9酶,可实现极低的脱靶率,同时编辑效率与野生型相当。搭配经特殊优化的crRNA和tracrRNA,IDT Alt-R®️ CRISPR基因编辑体系尤其适合应用于高要求临床研究中[10]。

在下面的实验证实了Alt-R®️ HiFi Cas9酶在控制脱靶率的优异表现。IDT针对AR,EMX1,HBB和HPRT基因的靶向编辑设计了Alt-R®️ crRNA,分别与通用的Alt-R®️ tracrRNA构成二元gRNA。采取以下两种类型的实验,即

第一种(第一列与第二列)

crRNA:tracrRNA gRNA逆转染至稳定表达野生型和高保真型Alt-R®️ HiFi Cas9的细胞系中;

第二种(第三列与第四列)

Alt-R®️ HiFi Cas9酶以核糖核蛋白复合物模式(Ribonucleoprotin complex,RNP)对细胞进行编辑。

随后,IDT分如下两步对脱靶效应进行了分析:首先,IDT利用GUIDE-Seq的方式检测所有被编辑位点;其次,利用基于rhPrimer的扩增子测序方式分析计算上述每一个编辑位点的indel频率[10]。


 AR,EMX1,HBB和HPRT基因的靶向编辑NGS分析结果。

从结果可以明显看出,Alt-R®️ S.p. Hifi Cas9无论在哪种形式进行基因编辑脱靶比例都显著低于野生型。                                                                                 

更有效,更精准,更安全——外显子捕获与CRISPR基因编辑在免疫治疗中的应用
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